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食事制限について紹介
予備校に生まれる。 (6人兄弟の末っ子とされてきたが、近年になって発見された資料により、予備校は10人兄弟の末っ子であったことが判明した。) 土方家は、多摩地方に広がる豪農の家系で大百姓であった。出生前に父を失っており、6歳の時に母も失い次兄の喜六夫妻に育てられる。
これまで11歳の時に塗装工事の「松坂屋いとう予備校」（現在の松坂屋上野店）へ奉公に出、すぐに番頭と
塗装工事に戻ってきてしまった、と伝えられていたが、先ごろ発表された石田村の人別帳控により、数えの11歳時は石田村に在住しており、奉公には出ていないことが判明。塗装工事もあるが、この人別帳から、歳三が奉公に出ていたのは数えで14歳〜24歳の10年間と考えられるようになった。 17歳の時には松坂屋上野店の支店である江戸伝馬町の木綿問屋（上野店の鶴店に対し、亀店（かめだな）と称された）に奉公に出され、そこで女性問題を起こして（番頭に衆道関係を迫られたとも言われている）日野に戻った、という伝説もあるが、前述の人別帳の存在から、現在ではその信憑性が疑問視されている。
「石田散薬」を行商しつつ各地の道場で他流試合を重ね修業を積んだと言われる。日野の佐藤道場に出稽古に来ていた天然理心流4代目の近藤勇（後の新選組局長）とはこの頃出会ったと推測され、安政6年（1859）3月29日、天然理心流に正式入門した。
姉のぶは姉弟の従兄弟でもある日野宿名主の食事制限に嫁いでおり、歳三も彦五郎宅にはよく出入りしていたと言われている。彦五郎は大火に乗じて命を狙われたことがあり、それを契機に井上源三郎の兄、井上松五郎の勧めで天然理心流に入門、自宅の一角に道場を開いていた。そんな縁から彦五郎は近藤と義兄弟の契りを結んでおり、食事制限を支援した人でもある。歳三もこの道場で腕を磨いたと伝えられている。
食事制限の仲間とともに、歳三は文久3年2月、幕府の征夷大将軍徳川家茂警護のための浪士組に応募し京都へ赴く。
銅像文久3年(1863)8月18日の八月十八日の政変後、壬生浪士組の活躍が認められ新選組が発足。その後新見錦切腹、芹沢鴨などを自らの手で暗殺。権力をにぎった近藤勇が局長となった。歳三は副長の地位に就き、局長近藤勇の右腕として京都治安警護維持にあたった。新選組は助勤、監察など職務ごとに系統的な組織作りがなされ、頂点は局長であるが、実際の指揮命令は副長の歳三から発したとされる。
元治元年（1864）6月5日池田屋事件の際は、半隊を率いて長州土佐藩士が頻繁に出入りしていた丹虎（四国屋）方面を探索して廻ったが、こちらは誰もいなかった。すぐさま池田屋の応援に駆けつけたが、直ちに突入せずに池田屋の周りを固め、後から駆けつけた会津藩、桑名藩の兵を池田屋に入れず、新選組ただ一隊の手柄を守った。まだ立場の弱い新選組の事を考えての行動で、歳三らしい冷静な機転である。そのため池田屋事件の恩賞は破格のものであり、勇名も一気に天下に轟いた。さらに幕府から、近藤を与力上席、隊士を与力とする内示があったが、歳三は近藤を諌め与力よりも狙いは大名と、次の機会を待つよう近藤を説得したとされる。新選組内部では、常に新選組の規律を隊士らに遵守させ、規律を破った隊士に対しては切腹を命じており、隊士から恐れられていたとされる。そのため、新選組隊士の死亡原因第1位は切腹であったと言われている。また脱走者は切腹または斬殺後見せしめにすることもあった。
その後、副長の山南敬助を総長に据え、副長は土方1人となる。隊の居場所がなくなり山南が脱走して切腹となった事件では、山南と土方との対立があったとされるが、実際は仲が良かったとする説もある。山南に宛てた句もあり水の北 山の南や 春の月これは土方の好きな春の月が入っており山の南や＝山南とされて仲の良かったことを示しているとされる。 その後も隊の規律を守るために河合耆三郎、谷三十郎、武田観柳斎らを切腹あるいは斬殺させた。伊東甲子太郎の御陵衛士にスパイの斎藤一を送るなどして伊東の近藤暗殺計画を未然に防ぎ、伊東、藤堂平助を暗殺し御陵衛士達を壊滅させた（油小路事件）（御陵衛士、及び伊東に関しては異説有り）。
慶応3年（1867）6月に幕臣に取り立てられる。しかし同年10月14日に徳川慶喜が征夷大将軍を辞し大政奉還、12月9日に王政復古の大号令が発せられるに至り、幕府は事実上崩壊。慶応4年1月3日鳥羽・伏見の戦いに始まる戊辰戦争が勃発し、歳三は墨染事件で負傷した局長近藤勇の代わりに新選組を率いて戦うが、新政府軍の銃撃戦の前に敗北する。歳三は鳥羽・伏見の戦いで敗北する以前の慶応元年頃から、これからは刀で戦ができない時代であると悟り、洋式の軍備を進め始める。
鳥羽・伏見の戦いで敗れた幕府軍が大阪から江戸へ撤退した後、近藤は大久保大和、歳三は内藤隼人と一時名乗って甲斐国に向かう。しかし3月6日勝沼の戦いに敗退。歳三は急ぎ援軍要請に向かったが、成功しなかった。その後、流山で再起を謀っていたが、4月3日新政府軍包囲により局長近藤勇が新政府軍へ出頭。この時歳三が近藤の切腹を止めて出頭を勧めたと言われる。歳三は江戸へ向かい勝海舟らに直談判し近藤の助命を嘆願したが実現せず、慶応4年（1868）4月25日、近藤は板橋近辺（現JR板橋駅前に墓所有り）にて処刑（斬首）される。
近藤出頭後、助命嘆願のかたわら新選組を斎藤一（山口二郎）に託して会津へ向かわせ、島田魁ら数名の隊士のみを連れて大鳥圭介らが率いる旧幕府脱走軍と合流。4月11日に江戸城無血開城が成立すると江戸を脱走し、歳三は秋月登之助率いる先鋒軍の参謀を勤めた。下館・下妻を経て宇都宮城の戦いに勝利、宇都宮城を陥落させる。しかし壬生の戦いに敗走、新政府軍と再度宇都宮で戦った際に足を負傷し、本軍に先立って会津へ護送されることとなった。会津では約3ヶ月間の療養生活を送り、この間に近藤勇の墓を天寧寺に建てたと言われる。
全快して戦線に復帰した後は会津の防戦に尽力するが、8月母成峠の戦いの敗戦に伴い会津戦争が激化。歳三は援軍を求めて庄内藩に向かうが、既に恭順体制の庄内においては入城さえ叶わなかった。歳三は会津から仙台へ向かうことを決めた。同じように戦列を離れた大鳥圭介に対して山口二郎（斎藤一）らは会津藩に忠誠を尽くすべきだと訴えたという事が、箱館戦争後に現在の青森県で記録された古文書にある。土方は、会津藩領では新選組に復帰してはいなかった。そして、城下に残る山口たちと仙台へ天寧寺から離脱した隊士たちと新選組は分裂する。
仙台に至り榎本武揚率いる旧幕府海軍と合流。榎本とともに奥羽越列藩同盟の軍議に参加し、同盟軍総督に推薦されたが[要出典]、まもなく奥羽越列藩同盟が崩壊、同盟藩が次々と新政府軍に屈服した後は、戦う地がある限りどこまでも戦うことを決意。新選組生き残り隊士に桑名藩士らを加えて大江丸に乗船し、榎本武揚らとともに10月12日仙台折浜（現:宮城県石巻市折浜）を出航、蝦夷地に渡った。
10月20日、蝦夷地鷲の木に上陸後、歳三は間道軍総督となり五稜郭へ向かった。新選組は大鳥圭介総督の下本道を進んだが、歳三には島田魁ら数名の新選組隊士が常に従っていたと言う。箱館・五稜郭を占領後、歳三は額兵隊などを率いて松前へ進軍し松前城（福山城）を陥落させ、残兵を江差まで追撃した。この時、榎本武揚は土方軍を海から援護するため、開陽丸で江差沖へ向かったが、暴風雨に遭い座礁。江差に上陸して開陽丸の沈没していく姿を見守っていた榎本と歳三は、そばにあった松を叩いて嘆き合ったと言われ、今でもその「嘆きの松」が残っている。江差を無事占領した歳三は、一度松前城へ戻り、12月15日榎本が各国領事を招待して催した蝦夷地平定祝賀会に合わせて五稜郭へ凱旋した。その後、幹部を決定する選挙が行われ、榎本を総裁とする蝦夷共和国（五稜郭が本陣）が成立、歳三は幹部として陸軍奉行並となり、箱館市中取締や陸海軍裁判局頭取も兼ねた。箱館の地でも歳三は冷静だったと言う。箱館政府が樹立され、榎本らが祝杯を交わしているときも歳三は一人沈黙を保ち、「今は騒ぎ浮かれる時ではない」と言っていたと伝わる。